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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔直腸黏膜上皮分離自直腸組織；直腸為大腸的未段，位于小骨盆內(nèi)。上端平第3骶椎處接續(xù)乙狀結(jié)腸，沿骶骨和尾骨的前面下行，穿過(guò)盆膈，下端以門(mén)而終。直腸上端的大小似結(jié)腸，其下端擴(kuò)大成直腸壺腹，是糞便排出前的暫存部位，下端變細(xì)接管。直腸在盆腔內(nèi)的位置與骶椎腹面關(guān)系密切，與骶椎有相同的曲度。直腸周?chē)嘀尽o(wú)縱帶，位于膀胱和生殖器官的背側(cè)。直腸的動(dòng)脈血供主要是來(lái)自腸系膜下動(dòng)脈的直腸上動(dòng)脈，來(lái)自髂內(nèi)動(dòng)脈的直腸中動(dòng)脈和來(lái)自髂內(nèi)動(dòng)脈的直腸下動(dòng)脈。腸黏膜上皮細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的重要屏障，持續(xù)暴露于大量抗原中，也是機(jī)體面對(duì)病原微生物的道防線(xiàn)。因此，腸黏膜上皮細(xì)胞除有吸收、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生理功能之外，在黏膜先天性和獲得性免疫防御機(jī)制中也起著重要作用。腸黏膜上皮細(xì)胞作為先接觸抗原的細(xì)胞，在黏膜免疫反應(yīng)的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，它決定黏膜免疫反應(yīng)的發(fā)生、性質(zhì)和強(qiáng)度。

方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔直腸黏膜上皮采用先機(jī)械分離法、后膠原酶消化法并通過(guò)上皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的兔直腸黏膜上皮經(jīng)Cytokeratin-18免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔直腸黏膜上皮體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專(zhuān)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶(hù)自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶(hù)用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶(hù)收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠β防御素(β-Defensin)檢測(cè)試劑盒 ，英文名： β-Defensin ELISA Kit

Mouse thyroopin releasing hormone (H) ELISA Kit 小鼠促甲狀腺素釋放激素(H)檢測(cè)試劑盒

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通用型密執(zhí)歲棍狀桿菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganenesis;Cmm)試劑盒20次

ELISAKitVEGF-B大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子B

CSF2重組大鼠 GM-CSF / CSF2 蛋白 (Fc 標(biāo)簽) Protein

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COLGALT2 Protein Human 重組人 GLT25D2 蛋白

VSIG4 Protein Mouse 重組小鼠 VSIG4 蛋白

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COLGALT2 Protein Human 重組人 GLT25D2 蛋白

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小鼠色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human endotoxin (ET) ELISA Kit 人內(nèi)毒素(ET)檢測(cè)試劑盒

HumanαLactalbumin,α-LaELISAKit 人α乳清蛋白(α-La)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

GoatTumornecrosisfactorα,TNF-α檢測(cè)試劑盒山羊壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

真菌/酵母0脂酶D(PhospholipaseD)總活性熒光定量檢測(cè)試劑盒20次

MouseClusterofdiffereiation19,CD19ELISAKit小鼠CD19分子(CD19)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔直腸黏膜上皮細(xì)胞小鼠膀胱抗原(BTA)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠半乳糖6酯酶(Gal-6S)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠半胱酸蛋白酶抑制劑/胱抑素C(Cys-C)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠白血病抑制因子受體(LIFR)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝