產品名稱：Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒
產品特點：Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒的相關產品：CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促腎上腺皮質激素釋放因子IL17RC Protein Human 重組人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 標簽)
產品型號：
更新日期：2024-11-19
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Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒的詳細資料：
產品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：
產品英文名稱：Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection kit
產品中文名稱：Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒
規格：20T/50T/100T
貨號：EY-01X8541
用途：僅供科研研究實驗
特點&優勢:
• 標準化，具有陽性對照。解決凋亡檢測的非標準化問題
• 熒光強度和光穩定性更好；EGFP是FITC的替代物，熒光強度和光穩定性更好
• 適用于流式細胞術和熒光顯微鏡
保存建議:-20℃，避光保存12個月。
運輸條件:藍冰運輸
背景
細胞凋亡（apoptosis）是一種基本生物學現象，指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。在正常活細胞中，磷脂酰（PS）位于細胞膜的內側，而在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。膜聯蛋白V(Annexin V) 是一種分子量為35~36KDa的鈣離子依賴型磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。通過熒光素或者標記Annexin V即可簡單快速地直接檢測出細胞早期凋亡情況。 碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核染上。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。PI可以被488,532或546nm激光線激發，并發出紅色熒光。
本產品具有下列特點:
1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟。
2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。
3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臜產物。
4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數后可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成。
操作步驟：
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
(二)構建重組表達載體
1、載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三) 獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
(四)誘導表達
1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
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