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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

髓核是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間。由縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細(xì)胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。

髓核細(xì)胞的過(guò)早衰老與凋亡是導(dǎo)致椎間盤(pán)退行性變過(guò)程的主要原因之一，主要表現(xiàn)為退變椎間盤(pán)內(nèi)髓核細(xì)胞功能降低和數(shù)量減少，使得其 Ⅱ型膠蛋白聚糖等基質(zhì)分泌量下降，終導(dǎo)致椎間盤(pán)維持脊柱高度、承受各方應(yīng)力等生物力學(xué)功能喪失。

細(xì)胞特性：

1）組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常椎間盤(pán)組織。

2)細(xì)胞鑒定：Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)熒光染色為陽(yáng)性。

3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、、酵母和。

5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：梭形或多角形細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。

推薦培養(yǎng)基：

我們推薦使用 DELF 原代 軟骨 細(xì) 胞培養(yǎng)體系 作為體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

公司正在出售的產(chǎn)品：

小鼠酶2(CA-2)ELISA 試劑盒

Rat activated protein C (APC) ELISA Kit 大鼠活化蛋白C(APC)檢測(cè)試劑盒

HumanCytochromeP450c21/21-hydroxylase,CYP21BELISAKit 人細(xì)胞色素P450c21B/21-羥化酶(CYP21B)檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口分裝

Cobravenomfactor,CVF檢測(cè)試劑盒毒蛇因子(CVF)檢測(cè)試劑盒

載玻片細(xì)胞鈣ATP酶SERCA蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒10/20次

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SDF-1/CXCL12 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 0.5mgSDF-1/CXCL12 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1

CA10重組人 Carbonic Anhydrase X / CA10 蛋白 (His 標(biāo)簽) Protein

AMBP Protein Human 重組人 AMBP / Alpha 1 microglobulin 蛋白 (His 標(biāo)簽)

IL1RAPL2 Protein Human 重組人 IL-1R9 / IL1RAPL2 蛋白

SDF-1/CXCL12 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 0.5mgSDF-1/CXCL12 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1

AMBP Protein Human 重組人 AMBP / Alpha 1 microglobulin 蛋白 (His 標(biāo)簽)

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豬膽囊收縮素/腸促肽(CCK)ELISA 試劑盒

Human macrophage colony stimulating factor (M-CSF) ELISA Kit 人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)檢測(cè)試劑盒

Porcinemelanomametastasissurfaceadhesionmolecule,MMSAMELISAKit 豬黑色素瘤轉(zhuǎn)移表面黏附分子(MMSAM)檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口分裝

CLIAKitforAlpha1-MGELISAKit大鼠α1微球蛋白

血液0酸二酯酶1(PDE1)活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測(cè)試劑盒10次

Mouseβ-galactosidase,βGALELISAKit小鼠β半乳糖苷酶(βGAL)檢測(cè)試劑盒

兔髓核細(xì)胞豬α葡萄糖苷酶（α-Glu）檢測(cè)試劑盒     試劑盒   組裝/原裝

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豬S-100B蛋白（S-100B）檢測(cè)試劑盒     試劑盒   組裝/原裝

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶(hù)自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶(hù)用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶(hù)收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。