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VE Elisa Kit蛋白測(cè)序操作步驟

1 多肽鏈的拆分。VE Elisa Kit由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基).

2 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護(hù)(元素后數(shù)字為下標(biāo))

a 過(guò)甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

-S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

VE Elisa Kit可以通過(guò)加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力;應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基(-SH)的保護(hù)

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，zui重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法)，C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法)。

6 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段。可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。

7 測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

VE Elisa Kit一般采用處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

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